"Técnicas de tinción".

Técnica de tinción de Gram

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884.

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tinción de GRAM.

Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana.En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

·         Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.

·         Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación.

·         A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados después de la división celular, aparecer por pares, formar cadenas, o agruparse de manera irregular.

·         Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena o en empalizada.

Materiales:

1. Mechero
2. Asa
3. Desinfectante
4. Microscopio. Laminilla y cubre-objeto
5. Bandeja para hacer tinción.

Agentes:

1.    Tinte cristal violet

2.    Iodo. Grams iodine

3.    Alcohol o descolorizante.

4.    Safranina

5.    Agua

Metodologia

• Recoger muestras.
• Hacer el extendido en espiral.
• Dejar secar a temperatura ambiente.
• Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
• Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
• Enjuagar con agua.
• Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
• Enjuagar con agua.
• Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion)
• Enjuagar con agua.
• Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
• Enjuagar con agua.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

Técnica de tinción de Ziehl-Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos.Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo y Friedrich Neelsen, un patólogo.

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina.Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes:

1. ácido periódico 58%
2. carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:
1. 0,5 g fucsina básica
2. 50 cc agua destilada
3. 5 cc etanol absoluto
4. 28,5 g cristales de fenol derretidos
3. hematoxilina
4. alcohol ácido 1%:
1. alcohol de 35º
2. ácido clorhídrico

El procedimiento es el siguiente:

1. desparafinar e hidratar los cortes
2. ácido periódico 5%, 10 min
3. lavar con agua destilada
4. fucsina fenicada, 15 min
5. decolorar en alcohol ácido al 50%
6. lavar con agua destilada
7. hematoxilina, 10 min
8. azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
9. deshidratar, aclarar y montar preparaciones

El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

Tinción hematoxilina-eosina

 

La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es uno de los métodos mas populares de tinción utilizado en histología y medicina diagnostica.
El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas en tonos Azul y Púrpura, como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.

HEMATOXILINA

1)    HEMATOXILINA

                                          i.    Es un colorante NATURAL.

                                         ii.    Hay que oxidarla.

                                        iii.    Proceso de oxidación:

                                       iv.    Maduración de la HEMATOXILINA.

2)    HEMATOXILINA

a.    La HEMATOXILINA tiñe:

b.    Estructuras ácidas

c.    Estructuras Basófilas

d.    Y existen algunos tipos …

3)    HEMATOXILINA

a.    Para la coloración con Hematoxilina se utilizan los siguientes:

b.    Ingredientes

c.    1 g Hematoxilina

d.    20 g Alumbre potásico

e.    0,5 g Oxido de mercurio

f.     200 cc Agua destilada

4)    HEMATOXILINA

a.    Se siguen los siguientes pasos:

b.    Disolver la Hematoxilina con el alcohol en un vaso de precipitados

c.    Calentar el agua destilada en un matraz o vaso de precipitados, y antes de hervir retirar el matraz y añadir el alumbre potásico

d.    Añadir la Hematoxilina disuelta en el alcohol y poner otra vez al fuego hasta la ebullición

e.    Sacar del hornillo y echar el óxido de mercurio

f.     Filtrar

EOSINA

1. EOSINA
1. Es un polvo rojo cristalino
2. C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5
3. Se utilizó mucho a finales del siglo XIX
4. Actualmente existen dos tipos de EOSINA
2. EOSINA
1. FUNDAMENTO
2. Es un compuesto ácido
3. Tiene una polaridad negativa
4. Colorea componentes y orgánulos citoplasmáticos, colágeno y fibras musculares
5. Los componentes que se tiñen con ésta se conocen como: acidófilos o eosinófilos
3. EOSINA
1. Preparación de la EOSINA
2. Agua destilada en un vaso de precipitados
3. 1 gota de ácido acético glacial por cada 100 cc de disolución
4. Se usa para reforzar la tonalidad rosa del tejido a colorear
5. Se pone en una estufa a unos 60º durante 30min
6. Luego se retira, se echa en un bote y se etiqueta
4. EOSINA
1. A pesar de su alta disponibilidad comercial, la EOSINA se puede preparar en el laboratorio sin dificultad ni necesidad de material especial.
2. Las preparaciones son muy estables, por lo que perduran mucho tiempo si son almacenadas convenientemente.

HEMATOXILINA-EOSINA

1. HEMATOXILINA-EOSINA
1. La HEMATOXILINA-EOSINA es una técnica de coloración que se utiliza luego de:
2. La fijación de la muestra
3. La deshidratación à Lavados de ALCOHOL
4. El Aclaramiento à Con XILOL
5. La inclusión en Parafina
6. El Corte
1. Y luego de este proceso viene la coloración con los tintes, pero para esto debemos desparafinar e hidratar la muestra con H 2 O para luego resaltar la tinción H.E. que tiene como resultado:
2. Colorear el núcleo de azul
3. El citoplasma de rosa
4. Los eritrocitos de rojo brillante